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山木通:直喷离子化质谱复杂疾速辨别山木通

1 引 言 
  木通为常用中药,可分为木通、川木通与关木通,汗青上三者被容许混用。固然传统上它们统称为木通,但三者泉源差别,木通属于木通科,川木通属于毛茛科,关木通属于马兜铃科[1]。丁林生等[2,3]对关木通的化学身分停止研讨,发明其含马兜铃酸和木兰花碱等身分。关木通中含有的马兜铃酸A会惹起人体肾脏侵害,属“有毒”类中药,已于2003年被取消了用药规范。但由于汗青遗留题目以及木通资源充足等缘由,关木通在市场上作为木通、川木通的替换品的景象屡禁不止。因而,树立一种疾速、复杂的关木通、木通和川木通的辨别办法至关紧张。 
  传统的辨别木通办法次要是依据3种药材表面性状的异同,依托经历停止区分,辨别后果不敷精确。谢丽莎等[4]应用紫外光谱组法对3种木通停止了辨别,但是它们的紫外吸取光谱很靠近,需先求得吸光系数再依据吸光系数的差别停止辨别; 李睿等[5]接纳近红外漫反射光谱法对3种木通停止了辨别,但该办法需求经二阶导数处置后树立聚类剖析模子; 孙萍等[6]应用LC-MS技能对3种木通停止了判定,但需求颠末繁琐的样品前处置进程,无机溶剂耗费大、操纵繁琐费时。 
  关闭式质谱技能作为一种疾速剖析技能,具有无需或仅需复杂的样品前处置、可完成样品原位剖析等长处[7~9]。自2004年Cooks等[10]提出该技能以来,失掉了敏捷开展。直喷离子化技能是关闭式质谱技能的一种,由于它具有复杂、易操纵、溶剂耗费少等特点,比年来被普遍使用于情况、食品、药品及大众平安等范畴[11~13]。但是,应用直喷离子化技能间接辨别3种木通的研讨还未见文献报道。 
  本研讨接纳直喷离子化质谱技能,经过对关木通的关闭式质谱表面停止剖析,提出了将木兰花碱作为关木通标记性身分停止辨别的办法,并接纳荷葉碱作为内标,对关木通中的木兰花碱含量停止了半定量测定。本办法复杂、疾速、敏捷,对木通的真伪辨别,尤其是有毒中药材关木通的辨别具有紧张意义。 
  2 实行局部 
  2.1 仪器与试剂 
  Thermo Finnigan-LCQ离子阱质谱,配LCQ-tune任务站(英国菲尼根公司); 高压直流电源(天津东文高压电源无限公司); LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司); 高速全能破坏机(北京市永黑暗医疗仪器无限公司); KQ3200E型超声波发作器(昆山市超声仪器无限公司); 喷雾滤纸购置于沃特曼公司。 
  马兜铃酸A和荷叶碱比较品(中国药品生物成品检定所); 木兰花碱比较品(上海源叶生物科技无限公司); 甲醇为色谱纯,别的试剂均为剖析纯,购于国药团体; 实行用水为二次蒸馏水。木通科木通、毛茛科川木通、马兜铃科关木通等药材均由九芝堂药学专家提供并停止判定。 
  2.2 质谱条件 
  实行接纳ESI离子源正离子形式,扫描范畴m/z 100~1000; 无需气体; 喷雾电压:+3.50 kV; 毛细管锥孔电压:10 V; 源温度:250℃。二级质谱碰撞能量:30%。 
  2.3 实行办法 
  直喷离子化技能次要在一个三角形滤纸(或其他小尖端物体)上停止:大批样品被提早加在滤纸(或别的小尖端物品)上,再用大批溶剂潮湿样品载体或样品自身,施加高压,此时样品被离子化,进入质谱仪。此技能分为样品装载、别离、离子化3个进程。直喷离子化表示图如图1。为了包管后果的重现性和精确性,滤纸或样品尖端距质谱入口的间隔牢固在5~10 mm左右。实行中,液体样品的进样接纳纸喷雾方法,固体样品的进样接纳间接喷雾方法。 
  2.4 木兰花碱纸喷雾半定量剖析 
  规范曲线的绘制:接纳荷叶碱作为内标,以木兰花碱与荷叶碱的信号强度比作为纵坐标,木兰花碱规范溶液的浓度作为横坐标树立规范曲线。木兰花碱的系列规范溶液浓度辨别为0.50、1.00、5.00、10.00和20.00 mg/L,内标荷叶碱的含量均为4 mg/L。用沃特曼滤纸做载体,取15 μL混淆规范溶液停止喷雾剖析。 
  样品溶液的处置:称取关木通药材粉末0.4 g, 参加20.00 mL无水乙醇(含冰乙酸0.50 mL),浸泡0.5 h,超声提取0.5 h,2000 r/min离心15 min,取上清液,参加盘算量的内标溶液,最初用甲醇浓缩至20 mL(内标荷叶碱的含量为4 mg/L)。 
  3 后果与讨论 
  3.1 木通、川木通与关木通药材间接喷雾剖析 
  在2.2节质谱条件下,对3种木通药材停止了间接喷雾和一级全扫描质谱剖析(图2)。由图2可知,在关木通的质谱中可以分明观察到m/z 342.08强峰,而木通、川木通在上述特性峰地位均无相应的峰呈现。 
  3.2 关木通的特性峰剖析 
  3.2.1 规范溶液纸喷雾剖析 依据关木通中特性峰m/z 342.08的信息,揣测此特性峰能够为马兜铃酸A (C17H11NO7,分子量341.27 )或木兰花碱(C20H24NO+4,分子量342.41)。为此,在异样质谱条件下,对两种物质的规范溶液停止了纸喷雾质谱剖析。由图3B可知,马兜铃酸A一级质谱次要质谱峰为[M+NH4]+(m/z 358.95)离子、[2M+NH4]+(m/z 699.76)离子和[2M+Na]+(m/z 704.83)离子,此中[2M+Na]+离子为基峰,在m/z 342处没有相应的分子离子峰,此后果与文献报道符合[14] 。而木兰花碱的一级质谱在m/z 342处有很强的峰 (图3A)。
 3.2.2 m/z 342纸喷雾二级质谱剖析 为了进一步验证关木通中的m/z 342峰的归属,对关木通提取液和木兰花碱规范溶液中m/z 342峰停止了纸喷雾二级质谱剖析。由图4可知,两者的碎片简直完全一样,各碎片离子的绝对品貌也根本分歧,且都以m/z 297.07为基峰,由此可以证明,关木通药材中的m/z 342.08峰确为木兰花碱。 
  3.2.3 关木通中马兜铃酸A和木兰花碱身分的液相色谱剖析 为了验证关木通中的马兜铃酸A和木兰花碱身分,同时应用液相色谱停止了却果验证,后果见图5。比拟规范溶液和提取液的液相色谱剖析后果及各峰相应的紫外图谱可知,关木通中的确存在马兜铃酸A和木兰花碱身分。 
  但是,关木通的关闭式质谱直喷测定后果中,并没有发明马兜铃酸A的特性离子,究其缘由,马兜铃酸A加合离子多,关闭式质谱呼应敏捷度较低。另一方面,從木兰花碱(5 mg/L)和马兜铃酸A(10 mg/L)混淆规范溶液的一级质谱图(图6)可见,木兰花碱的存在搅扰了马兜铃酸A的呼应。 
  由于木兰花碱的质谱呼应好,压低了马兜铃酸A的信号,从谱图上只能见到木兰花碱的峰,而见不到马兜铃酸A的峰。由此可见,应用马兜铃酸A难以停止关木通的判定,相反,接纳呼应信号好的木兰花碱停止辨别,可以取得更牢靠的关木通判定后果。 
  3.3 关木通中木兰花碱的半定量剖析 
  因马兜铃酸A和木兰花碱分子量相近,紫外呼应也很靠近,互相搅扰测定。接纳关闭式质谱剖析办法,可以去除关木通中马兜铃酸A的搅扰,对此中的木兰花碱停止半定量测定。以荷叶碱为内标,以木兰花碱与内标的信号强度比为纵坐标,木兰花碱规范溶液的浓度为横坐标树立线性干系,在 0.50~20.00 mg/L范畴内测得两者线性相干,相干系数到达0.9989,检出限为0.1 mg/L,对1.00、5.00和10.00 mg/L 3个浓度程度的木兰花碱平行测定,测得木兰花碱浓度的RSD<5%。 
  依照2.4节停止样品处置,平行6次,测得关木通提取液中木兰花碱的均匀含量为984.3 μg/g,RSD为4.7%。阐明本办法可用作关木通中木兰花碱半定量剖析的根据。本办法在无需样品预处置的状况下,可以依据木兰花碱疾速辨别关木通,而且检测后果波动,具有较好的反复性。 
  4 结 论 
  接纳直喷离子化质谱检测技能,在无需样品预处置的条件下,经过对关木通药材停止直喷剖析,剖析了此中马兜铃酸A和木兰花碱的关闭式质谱,取得了其正离子形式下的指纹图谱,找出了此中的标记性身分木兰花碱,树立了疾速检测关木通中木兰花碱的半定量剖析办法,可乐成使用于有毒药材关木通与木通、川木通的辨别。本办法复杂、疾速、精确,为中药材的质量控制提供了参考。 
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阅读次数:  更新工夫:2017-10-21 19:16:08
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